Impact of D-2HG on the Tumor Microenvironment of IDH-mutated Gliomas
Impact du D-2HydroxyGlutarate sur le micro-environnement tumoral des gliomes avec mutation IDH
Résumé
Background: Diffuse gliomas are the most common primary malignant tumors of the central nervous system. A subset of these tumors harbors mutations in the genes encoding isocitrate dehydrogenase 1 or 2 (IDH), which confer a neo-activity that converts alpha-ketoglutarate (α-KG) produced by the wildtype enzyme into D-2-hydroxyglutarate (D-2HG). The accumulation of this oncometabolite competitively inhibits α-KG-dependent dioxygenases, including the TET (Ten Eleven Translocase) family of DNA hydroxylases and the JmjC/KDM family of histone demethylases. This ultimately leads to hypermethylation of both histones and DNA in tumor cells. Tumor-associated macrophages and microglia (TAMs) are abundant myeloid cells in gliomas, with their phenotype and immune responses shaped by ontogeny and the tumor microenvironment. The characteristics of TAMs differ depending on the IDH status of the glioma, yet the regulatory mechanisms underlying these differences remain poorly understood. D-2HG released by IDH-mutant (IDH-m) glioma cells into the microenvironment may affect the phenotype and function of TAMs. We hypothesized that D-2HG may influence the epigenome of TAMs, as in the case of tumor cells.Materials and Methods: We compared the bulk DNA methylome (Methylation EPIC array) and transcriptome of TAMs (CD11B+ cells purified via magnetic-activated cell sorting) from 25 IDH-mutant (IDH-m) and 11 IDH-wildtype (IDH-wt) gliomas, as well as control tissues. To experimentally assess the direct effects of D-2HG, the oncometabolite produced and released by IDH-m glioma cells, we used primary cultures of human microglial cells obtained from glioma or epilepsy surgeries. We first measured D-2HG levels in D-2HG-treated microglia using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm metabolite uptake, and evaluated TET enzymatic activity. Bona fide IDH-m and IDH-wt cells were used as external controls. Microglia were exposed to D-2HG for 14 days, after which we analyzed their DNA methylome and transcriptome. Ratios of 5mC/5hmC were examined at single-base resolution. We evaluated the transcriptomic response and the mitochrondrial respiration after LPS stimulation of microglia pre-treated with D-2HG. Lastly, we performed single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) on microglial cells from a paired IDH-m glioma sample, before and after treatment with the IDH-m inhibitor ivosidenib, known to reduce intratumoral D-2HG levels.Results: Our analysis revealed that CD11B+ myeloid cells in human IDH-m gliomas exhibit DNA hypermethylation predominantly at distal enhancers. This hypermethylation is associated with decreased expression of genes involved in inflammatory responses and glycolytic metabolism, as well as the inactivation of transcription factors critical for microglial response to environmental stimuli. Prolonged exposure of primary human microglia to D-2HG inhibited TET-mediated 5mC oxidation, leading to reduced global 5hmC accumulation. High 5mC/5hmC ratios were particularly prominent at lineage-specific enhancers. Consistent with this altered enhancer landscape, D-2HG-treated microglia demonstrated diminished proinflammatory capacity and enhanced oxidative phosphorylation. Conversely, depletion of D-2HG following ivosidenib treatment in an IDH-m glioma patient was associated with the restoration of microglial gene expression related to activation.Conclusion: Our findings provide mechanistic insight into the hyporesponsive state of microglia in IDH-m gliomas and support the concept that oncometabolites, such as D-2HG, can disrupt the function of immune cells in the tumor microenvironment.
Contexte : Les gliomes diffus sont les tumeurs primitives malignes du système nerveux central les plus fréquentes. Certains présentent une mutation du gène codant pour l'isocitrate déshydrogénase 1 ou 2 (IDH) qui leur confère la néo-activité de transformer l'alpha-cétoglutarate (α-KG) produit par l'enzyme non mutée en D-2hydroxyglutarate (D-2HG). L'accumulation de cet oncométabolite entraîne l'inhibition compétitive des dioxygénases dépendantes de l'α-KG, incluant la famille TET (Ten Eleven Translocase) des ADN hydroxylases, et les JmjC/KMDs histone déméthylases, qui conduit elle-même à l'hyperméthylation des histones et de l'ADN des cellules tumorales. Les macrophages et microglies associés aux tumeurs (TAMs) sont des cellules myéloïdes très abondantes dans les gliomes, dont le phénotype et la réponse immunitaire sont déterminés par l'ontogenèse et le microenvironnement. Les TAMs présentent des caractéristiques différentes en fonction du statut IDH du gliome, mais les mécanismes de régulation sous-jacents restent largement méconnus. Le D-2HG relargué dans le microenvironnement par les cellules de gliomes IDH-mutants (IDH-m) pourrait influencer le phénotype et la fonction de ces TAMs. Nous avons émis l'hypothèse que le D-2HG pourrait modifier l'épigénome des TAMs, comme dans le cas des cellules tumorales.Matériel et méthodes : Nous avons comparé le méthylome (puce EPIC de méthylation) et le transcriptome des TAMs (CD11B+ isolés par tri cellulaire activé par magnétisme) de 25 gliomes IDH-m et 11 gliomes IDH-wildtype (IDH-wt), ainsi que de tissu cérébral contrôle non tumoral. Pour déterminer les effets directs du D-2HG sur la microglie, nous avons mis au point des cultures primaires de microglie humaine obtenues à partir d'une chirurgie de gliome ou d'épilepsie. Nous avons d'abord dosé le D-2HG dans la microglie traitée par D-2HG par spectrométrie de masse par chromatographie en phase liquide (LC-MS) afin d'évaluer l'entrée du métabolite dans ces cellules, et avons évalué l'activité enzymatique de TET. Nous avons exposé ou non des cellules microgliales au D-2HG pendant 14 jours et analysé leur méthylome et leur transcriptome. Les ratios de 5mC/5hmC ont été analysés à une résolution de base unique. Nous avons évalué la réponse transcriptomique et la respiration mitochondriale après stimulation au LPS de la microglie pré-traitée par D-2HG. Enfin, nous avons analysé par snRNA-seq le transcriptome microglial d'un échantillon apparié de gliome IDH-m avant et après traitement par l'inhibiteur d'IDH-m ivosidenib, qui diminue les concentrations intratumorales de D-2HG.Résultats : Nous montrons que les cellules myéloïdes CD11B+ des gliomes IDH-m humains présentent une hyperméthylation de l'ADN principalement au niveau des enhancers. Cette hyperméthylation est liée à une diminution de l'expression des gènes impliqués dans les réponses inflammatoires et le métabolisme glycolytique, et à l'inactivation des facteurs de transcription qui régulent la réponse microgliale aux stimuli environnementaux. L'exposition prolongée de la microglie primaire humaine au D-2HG inhibe l'oxydation de 5mC médiée par TET, ce qui entraîne une accumulation réduite des niveaux globaux de 5hmC. Nous avons observé des rapports 5mC/5hmC élevés, en particulier au niveau d'enhancers spécifiquement actifs dans ces cellules. Conformément à la modulation des enhancers, la microglie traitée au D-2HG présente une capacité pro-inflammatoire réduite et une augmentation de la phosphorylation oxydative. À l'inverse, la diminution des niveaux de D-2HG après traitement par ivosidenib chez un patient atteint de gliome IDH-m est associée à la restauration de l'expression génique liée à l'activation microgliale.Conclusion : Nos résultats fournissent une base mécanistique de l'état hyporéactif de la microglie dans les gliomes IDH-m et élargissent le concept selon lequel les oncométabolites peuvent perturber la fonction des cellules immunitaires du microenvironnement tumoral.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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